一种以4.1R、CD29为靶点的抗肿瘤药物筛选模型的制备方法及其应用，以蛋白4.1R基因敲除小鼠为实验材料制备C57BL/6J 4.1R-/-MEF原代细胞，用SV40大T抗原转化法得到的永生化C57BL/6J 4.1R-/-MEF。本发明的目的是为以蛋白4.1R和CD29为药靶的新药筛选和基因治疗提供离体细胞筛选模型。其优点在于：避免了因基因敲除动物饲养成本高，原代细胞在体外传代受限等对以4.1R为治疗靶的药物筛选和生产产生的局限。降低靶向新药生产成本。本发明所建立的C57BL/6J 4.1R-/-MEF，细胞表面CD29活化由于4.1R的缺失而被抑制，可以成为生产以CD29为靶向，研究与细胞增殖和迁移、细胞因子分泌、细胞信号转导调控及肿瘤耐药等相关的抗肿瘤新药的筛选模型。