本发明提供一种双基因表达质粒及其用途。本发明所提供的质粒能够同时表达出两种外源基因，其包括两组来源于λ噬菌体的受控于温度敏感阻抑物cIts857的热启动子PRPL启动子，分别控制位于其下游的两种外源基因的表达。本发明所提供的原核双基因表达质粒，所表达的外源基因分别为编码红色荧光蛋白的基因和编码有机磷水解酶的基因。本发明还利用该质粒构建出生物工程菌，其能不经诱导就表达出目的基因。本发明利用来源于λ噬菌体的热启动子构建了双基因表达质粒，利用该质粒模式可以同时独立表达两种外源目的基因，选择合适的表达菌株则可以避免诱导剂的使用，开阔了以质粒为载体用于生物工程菌构建的应用前景。