本发明涉及用于抑制流行性乙型脑炎病毒的siRNA，及其设计方法和用途。具体地，本发明根据流行性乙型脑炎病毒的全基因组序列，选取在基因1型、2型、3型和4型分离株中的保守序列作为靶序列。根据靶序列设计的siRNA分子在导入细胞后，能够有效抑制乙脑病毒基因的表达；当不同的siRNA分子串联后导入细胞，能获得更好的抑制效果。本发明还涉及所述的siRNA分子用于抑制流行性乙型脑炎病毒基因表达的用途以及用于制备治疗和/或预防流行性乙型脑炎的药物的用途。本发明为抑制各种不同基因型乙脑病毒引起的感染提供了新的途径。