本发明涉及一种组织工程人角膜上皮的重建方法，是利用含20％小牛血清的DMEM/F12培养液将人角膜上皮细胞体外培养至对数生长期，采用胰蛋白酶和胰蛋白酶-EDTA消化法获得完全去除上皮层的消化羊膜载体支架，平铺在插入式培养皿中牢固干贴后，将悬浮于含有IV型胶原蛋白和10％小牛血清的DMEM/F12培养液的对数生长期人角膜上皮细胞，接种至平铺有去上皮层消化羊膜载体支架的插入式培养皿中采用气-液界面培养法进行组织工程人角膜上皮的体外重建。本发明工艺科学合理，所重建的组织工程人角膜上皮可用于批量生产，满足广大角膜上皮病盲患者临床角膜移植治疗对组织工程人角膜上皮的大量需求，且组织工程人角膜上皮体外重建和临床治疗的成本低。