本发明涉及一种人角膜上皮细胞系的构建方法，构建方法是先将角膜消毒，再将角膜消化后，取下带有前弹力层的角膜上皮，剪成小的组织块后，将组织块向下平贴于培养孔的底部，然后加入培养液在二氧化碳培养箱中、37℃下进行贴板培养，培养期间更换培养液，细胞长成单层后进行传代培养，现已传至60代以上完成了人角膜上皮细胞系的构建；其中，培养液为含有20％胎牛血清、0.02‰～0.04‰的人表皮细胞生长因子、0.01‰～0.02‰的人碱性成纤维细胞生长因子、0.4‰～1.0‰羧甲基壳寡糖和0.25‰～1‰硫酸软骨素的DMEM/F12培养液，此外培养液还添加了0.08‰～0.1‰的IV型胶原。本发明的构建方法利用人角膜上皮组织成功建立了未经转染的人角膜上皮细胞系，建立的细胞系可以连续传代，能提供出大量的人角膜上皮细胞。