本发明提供一种流体检测试片及其测试方法。流体检测试片包含有具有流道的基板，流道上设置有依序连接的第一流体区、第二流体区与第三流体区。此外，流道具有位于第一流体区的第一抗体、位于第一流体区或第二流体区的醣类材料及过氧化物酶、固定于第二流体区的第二抗体，并与第一抗体辨识同一待测物上相异的抗原决定位置、位于第三流体区中的发光剂与包含有醣氧化酶的受质反应试剂。当流体注入流道后，利用醣氧化酶催化流至第三流体区的醣类材料，并产生出过氧化氢，并同流至第三流体区的过氧化物酶催化发光剂进行反应，产生光学信号。