本发明涉及生物技术领域，公开了一种定量检测Exendin-4的酶免疫分析方法，包括第二抗体包被酶标板，BSA封闭；加抗Exendin-4第一抗体孵育；加Exendin-4标准品及样品，并设立对照，加生物素标记Exendin-4孵育；加辣根过氧化物酶标记链霉亲和素孵育；加pH7.5的PBS配制的0.5-2mg/ml HPPA和过氧化物溶液的混合液避光孵育；加甘氨酸缓冲液终止反应，于荧光酶标仪上读取相对荧光单位(RFU)值，根据标准品浓度及其对应的RFU值制作标准曲线，计算出样品中Exendin-4含量。本发明所述方法灵敏度高，特异性强，稳定性好，成本低，可广泛应用于临床和非临床样品Exendin-4含量的检测。