本发明属于生物技术领域，提供了一个能介导对我国烟草病毒病抗性的RNAi载体pGEM-PCTRi。通过对我国烟草主要病毒马铃薯Y病毒(PVY)、黄瓜花叶病毒(CMV)和烟草花叶病毒(TMV)群体基因组特性的分析，选取了PVY CP、CMV RNA1和TMV CP基因中的保守且能诱导RNAi的三段有效序列；将三部分嵌合并构建反向重复序列，得到一个RNAi载体pGEM-PCTRi。利用该载体可以在大肠杆菌中大量生产dsRNA，处理烟草后可诱导烟草产生对PVY、CMV和TMV的抗性。本发明有应用于烟草田间生产中预防病毒病的潜力，且具有广谱、高效、不涉及转基因等优势。