本发明涉及一次性同时定量测定多种抗生素的方法，包括：(1)制备样品滤液；(2)设定液相色谱条件和质谱条件；(3)用上述的液相色谱条件和质谱条件测定步骤(1)中制备的样品滤液，分析数据确定分析样品中抗生素的种类和含量。本发明可以用一次实验同时检测出多种抗生素并同时对所检出的抗生素进行定量，液相色谱-质谱联用既解决了液相色谱中出峰时间相近的波峰难分离的问题，又克服了质谱中低离子电流强度出峰不明显而带来的误差；本发明可以广泛应用于粪便、土壤、水体、食品等各种样品中抗生素的检测及定量分析。