本发明公开了一种多肽或蛋白含量标准物质定值方法，该方法包括如下步骤：高效液相色谱分离待测样品中的主要成分和杂质；收集分离出的各个组分，将各个组分分别水解为氨基酸，得到各个组分的水解液；向所述各个组分的水解液中加入同位素标记的稳定氨基酸，通过高效液相色谱-同位素稀释质谱法，以国家氨基酸标准物质为标准，测定各个组分中氨基酸的质量分数，计算主要成分水解得到的氨基酸的比例系数；将待测样品水解为氨基酸，得到待测样品水解液，向所述待测样品水解液中加入同位素标记的稳定氨基酸，通过高效液相色谱-同位素稀释质谱法，以国家氨基酸标准物质为标准，测定待测样品水解液中氨基酸的质量分数；计算待测样品中多肽和蛋白的质量分数。本发明的多肽或蛋白含量含量标准物质定值方法准确性高，定值结果可最终溯源到SI单位。