本发明涉及一种D-甘露糖的生物制备方法，其将原料魔芋粉在酸性条件以及温度80℃～120℃下进行水解获得魔芋粉的水解液；然后调节水解液的pH至5～7，加入重量为魔芋粉重量的1％～10％的酵母菌，在温度28℃～40℃下进行发酵，结束后，进行脱色和除去酵母菌，然后采用阴离子交换树脂和阳离子交换树脂将溶液中的阴离子和阳离子除去；最后对溶液进行浓缩，至糖浆浓度为70wt％～90wt％，加入溶剂和D-甘露糖的晶种，析晶，离心得到D-甘露糖的粗品。本发明创新地使用魔芋粉为原料，采用生物发酵技术制备D-甘露糖，不仅所得产品纯度较高，收率高，而且，本发明工艺简单，操作容易，适用于工业化生产。