本发明提供一种肠道病毒三联实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，包含：定量RT-PCR反应液、标准品、对照品，其中定量RT-PCR反应液含有RT-PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、EV通用引物、EV通用型荧光探针、EV71型荧光探针、CA16型荧光探针、耐热DNA聚合酶、反转录酶。本发明试剂盒通过一步法同时对肠道病毒通用型、肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组16型进行检测分型，比现有的单个检测试剂盒，不仅节约了生产成本和检测成本，同时也提高了检测的效率和时间。并在保证没有多对引物竞争的条件下随机自动的达到多通道的检测目的，达到效率和技术的统一。