本发明属于组织光学测量技术领域，涉及一种时域荧光层析成像系统标定方法，该方法用于标定系统各个通道传输因子，步骤如下：搭建用于替代成像系统中的成像腔的标定装置；将源光纤和探测光纤分别插在成像腔体上；在插槽内放置一些镜头纸，将探测光纤与第一通道相连；把780nm激光器打开，对与该通道相应的滤波轮上的所有中性滤光片的衰减率进行标定；把780nm激光器关掉，把830nm激光器打开，对该通道相应的滤波轮上的830nm长通滤光片的透过率的进行标定；重复上述步骤，完成对各个通道的滤波轮上所有中性滤光片的相对衰减率和830nm长通滤光片的透过率的标定。本发明能够消除系统通道传输性能上的差异。