本发明公开了一种利用谷胱甘肽分离混合液中半抗原的方法及应用，包括如下步骤：制备固定有谷胱甘肽S转移酶的亲和层析柱，向混合液中加入还原型谷胱甘肽溶液，混匀后恒温水浴，反复通过亲和层析柱，再用高浓度谷胱甘肽溶液冲洗亲和层析柱以洗脱结合到谷胱甘肽S转移酶上的半抗原复合物；分离步骤洗脱液中多余的谷胱甘肽，利用高效液相色谱法获得谷胱甘肽-半抗原复合物的各个单一组分。用本发明的方法可以迅速分离得到大量潜在的半抗原成分，方法简单易行，耗时短，可以有效节省时间和财力，还可为后续半抗原分析提供有力的技术支持。