本发明涉及一种含有结合雌激素的提取物及其提取纯化方法，包括以下步骤：将采集的孕驴尿样品经过大孔树脂吸附柱分离，采用水混溶性溶剂进行梯度洗脱，得到含有结合态雌激素的浓缩液；将提取的结合态雌激素浓缩液，经反相C18柱富集纯化，进行上样、水混溶性溶剂梯度洗脱、收集组分浓缩，得到纯化的结合态雌激素混合物；将纯化的结合态雌激素混合物，加水和醋酸缓冲液，震荡，然后加酶进行酶解，乙酸乙酯萃取，得到游离雌激素混合物。本发明采用苯乙烯型非极性共聚体D101大孔吸附树脂，再经C18反相柱纯化，首次从孕驴尿中得到结合态雌激素提取物，工艺简单，树脂可再生，节约成本，同时避免了常规使用的液-液和固-液提取法所产生的弊端。