本发明公开了一种焦磷酸测序技术检测隐孢子虫的方法，先依据隐孢子虫18S rRNA设计特异性引物及焦磷酸测序引物；再提取待测样品的脱氧核糖核酸(DNA)，然后分别以18SrRNA基因的特异性引物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增；用琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，若引物扩增片段长度为201bp，则制备焦磷酸测序单链模板，再进行焦磷酸测序反应，最后根据PCR扩增结果和焦磷酸测序结果来判定样品中是否含有贾第鞭毛虫。本发明适用于对隐孢子虫进行快速检测确证，可广泛应用于环境中的水质监控、人体粪便中卵囊检测及进出口贸易中该类原虫的确证，操作极为简便，所需样品量小。