本发明提供一种水蛭肽和制备方法及其应用，属于多肽及其制备领域。本发明重组水蛭素在大鼠体内的代谢过程中发现，其在大鼠体尿中的代谢产物具有更强的抗凝血酶活性。经过提取、分离和结构与鉴定，发现这种代谢产物为一组重组水蛭素C端去掉17-12个氨基酸的N端保留的水蛭肽，即水蛭肽rH1-51，水蛭肽rH1-52及其两者的混合物。制备方法主要为大鼠静脉给药，收集尿液，采用凝胶色谱（GF-HPLC）并结合反相高效液相色谱（RP-HPLC）提取纯化，即得。本发明提供的水蛭肽免疫原性将显著的降低，有望成为新一代抗血栓新药，具有良好的发展前景和临床应用价值。