本发明涉及一种药物指纹图谱的测定方法，具体涉及大黄提取物、黄连提取物、黄芩提取物和上述三种药物组成的药物制剂的指纹图谱的测定方法，本发明中供试品溶液的制备：取中药提取物，精密称量，置于容量瓶中，加乙醇溶解、定容、过滤即得供试品；色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相A：乙腈；流动相B：0.1％甲酸和20mM醋酸铵水溶液；检测波长为254nm；(c)测定：精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。本发明获得指纹图谱检测方法可重复性高、物质检测全面，且能直接与质谱仪联用，具有很好的药物监控效果。