本发明公开了一种壬基酚聚氧乙烯醚检测试剂盒，属于添加剂检测技术领域。该试剂盒包括每个微孔内包被浓度为0.25-2.5μg/mL壬基酚聚氧乙烯醚特异性抗原的酶标板，浓度为0.25-2.5μg/mL的壬基酚聚氧乙烯醚单克隆抗体工作液，且所述壬基酚聚氧乙烯醚特异性抗原与壬基酚聚氧乙烯醚单克隆抗体的用量为1:1。本发明还公开了一种壬基酚聚氧乙烯醚检测试剂盒的制备和使用方法。本发明的试剂盒在检测壬基酚聚氧乙烯醚时可以快速检测壬基酚聚氧乙烯醚在化妆品和涂料中的含量，具有特异性高，结果准确且前处理简单，对仪器设备要求低、检测成本低的特点。