本发明公开一种烟草中木质素含量的测定方法。本发明所述测定方法采用氢氧化钠/尿素溶液对烟草进行预处理，除去了烟草中的水溶性糖、蛋白质和其他游离杂质，然后采用低浓度的硫酸溶液处理，再在低温条件下采用氢氧化钠/尿素溶液溶解烟草中的纤维素和半纤维素，得到的不溶物即为酸不溶木质素，计算得到酸不溶木质素的含量，同时采用紫外吸收光谱法测定烟草酸溶木质素的含量，两者加和得到烟草木质素的含量。本发明的方法与现有技术比较，避免采用高浓度浓硫酸处理导致的木质素损失，使测试结果更准确，重复性好，且方法简便快捷。