本发明提供一种烟草雄性不育杂交一代种子的制种方法。所述制种方法是在海拔700米以下气候条件符合烟株前期营养生长和后期生殖生长的要求的环境下分开对母本烟株和父本烟株进行育苗，之后采取隔离种植，并对母本烟株打顶后，再收集父本花粉准备授粉，在授粉时加入淀粉混配采用人工授粉笔或授粉枪进行授粉，授粉前和授粉后均对母本烟株进行疏花，然后在蒴果果皮变褐80％以上时，分批次单果采收干燥后，进行脱粒加工制成雄性不育杂交一代种子。本发明设计合理、投入生产成本低、种子产量高，在保证品种纯度(99％)和种子发芽率(95％)的基础上，实现了优良种质繁殖系数的最大化，种子产量大幅提高，种子生产成本显著下降。