本发明公开了一种从微藻油或鱼油中分离纯化二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸的方法，包括如下步骤：（1）将酯型微藻油或酯型鱼油依次经过皂化和酸化处理后得到脂肪酸混合物；（2）将所述脂肪酸混合物溶于非极性溶剂中配成原料液，以极性溶剂或离子液体或离子液体-极性溶剂组成的二元混合溶剂为萃取剂，以与原料液相同的溶剂为洗涤剂，进行分馏萃取，收集萃取液；（3）根据萃取剂的沸点不同选择不同的后处理步骤得到二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸的混合物。本发明的方法从酯型微藻油或鱼油中分离，制备工艺简单，安全可靠，且产品纯度高，收率高。