本发明公开了一种用于PCR步移技术的半随机引物、试剂盒及运用所述试剂盒进行PCR步移的方法。所述半随机引物的序列如序列表中SEQSEQ ID NO.5所示。所述试剂盒包括所述半随机引物。所述方法同普通二条引物的PCR相类似，最多只需二轮PCR即可获得目标序列，操作简单、快速、高效。该方法通过提高了整个PCR循环过程中的退火温度，增加了扩增特异性，且对实验材料没有限制，微生物、动物和植物样品均可使用。本方法用于实验中可以简化操作，缩短实验时间，提高实验效率，降低实验成本，具有十分广阔的应用前景。