本发明公开了一种猪小肠复合抗菌肽的制备方法及用途，本发明先采用绞肉机、胶体磨将猪小肠组织捣碎匀浆、反复冻融，初步破碎细胞。随后进行隔水煮沸热处理，再用乙酸溶液浸提即能获得较多量的抗菌肽。后离心，使杂蛋白的量大大降低，离心所得上清液依次经切向流微滤膜、切向流超滤膜过滤，调节pH值后，再经切向流纳滤膜过滤浓缩和透析除盐，调节渗透压后除菌，即得猪小肠复合抗菌肽。本发明提出的猪小肠复合抗菌肽的用途，运用抗菌肽在粘膜免疫、免疫增强剂、新型抗生素等方面的作用，将抗菌肽用于粘膜免疫起重要功能的猪传染性胃肠炎-流行性腹泻及鸡毒支原体病的防控，及替代传统抗生素，效果显著。