本发明涉及一种连作花生土壤真核微生物群落演替的研究方法。该方法采用盆栽试验，选取未种植过花生的土壤，充分混匀后分与各盆，连续三年种植花生。连作三年的播种、收获时间一致。每个种植周期分别选取苗期、收获期收集花生根部土壤，并提取土壤基因组DNA，构建18S rRNA基因文库。通过对所构建文库进行分析比较，从而获知连作花生土壤真核微生物群落演替的规律。利用本发明，可以明确连作花生土壤真核微生物的群落结构以及优势类群，获知各真核微生物类群在花生连作过程中的演替规律。