本发明提供一种鉴定药用植物三叶青的方法，通过三叶青的特异性核苷酸序列以及基于该序列的特异性引物，利用PCR技术鉴定三叶青。本发明设计的引物，具有极高的专一性，在12个不同种源的三叶青中均可扩增出1800bp左右条带，与16个近缘物种和三叶青伪品土圜的DNA均不反应，可以快速、准确地鉴别三叶青。本发明方法用很少量样品即可完成整个鉴定操作，鉴定结果准确、灵敏度高，为药用植物三叶青的鉴定提供了客观、快速、准确的方法，解决了药材市场上伪品仿冒三叶青欺骗消费者的问题。