本发明公开一种单分子荧光装置及其使用方法，所述单分子荧光装置包括：镜头式全内反射荧光显微镜系统、图像采集及处理系统、可控磁镊系统和流体池系统，流体池系统包括流体池固定台、流体池及电动液流泵，所述流体池固定台的一面固定在所述镜头式全内反射荧光显微镜系统的倒置显微镜样品台上，所述流体池固定台的另一面上固定有所述流体池；所述电动液流泵与流体池相连；所述流体池的底面上设置有一列以上的DNA固定点。本发明由于在流体池中制作出了成列的DNA固定点，因此可以实现大量DNA的可控固定。再借由横向磁镊装置，即可实现对大量DNA分子的可控拉伸，并在不对DNA分子进行染色的情况下实现对蛋白质荧光信号的高精度观测。