本发明涉及一种基于口蹄疫A型VP1蛋白及其单抗的竞争ELISA方法，同时涉及口蹄疫A型VP1蛋白制备、及其单抗制备方法，属于动物免疫学检测技术领域。本发明利用引物对C1、C2和引物对E1、E2扩增得到口蹄疫A型VP1蛋白的基因序列，通过表达质粒构建、表达质粒导入原核表达宿主，诱导纯化得到口蹄疫A型VP1蛋白，以口蹄疫A型VP1蛋白为抗原，通过杂交瘤技术获得口蹄疫A型VP1蛋白单抗，并基于口蹄疫A型VP1蛋白及其单抗建立了能够用于检测口蹄疫A型抗体的竞争ELISA方法。本发明检测方法特异性强、稳定性好，可用于口蹄疫A型血清抗体的检测，结果与液相阻断ELISA检测试剂盒比对，符合率为95.8%。