本发明实施例公开了一种在线全二维液相色谱分离系统及方法。该系统包括：数据记录处理系统、进样系统、输液系统、检测系统、由离子交换柱和反相柱串联相通构成的二维色谱柱系统；数据记录处理系统控制进样系统将样品注入离子交换柱后，控制输液系统向二维色谱柱系统按照pH值单调增大或减小的顺序依次输送各种pH值的流动相，等度洗脱出不同组分进入反相柱中；在输送每种pH值流动相后，控制输液系统向二维色谱柱系统输送包含水相和有机相的流动相，梯度洗脱出极性不同的化合物；并控制检测系统检测并记录二维色谱柱系统的洗脱物的信号。利用本方案，可以高效分离复杂样品中的不同酸碱度和/或不同极性的至少两种化合物。