本发明涉及一种检测西马特罗药物残留的酶联免疫试剂盒及其制备方法与应用，属生物技术领域。该酶联免疫试剂盒含有包被有西马特罗药物抗原的酶标板、西马特罗药物单克隆抗体、酶标记物、西马特罗标准品溶液、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液、样本稀释液。该酶联免疫试剂盒的应用，主要包括的步骤为：样品前处理、操作方法及结果分析。本发明所述的检测西马特罗药物残留的酶联免疫试剂盒可用于动物组织（肌肉、肝脏）、尿液、饲料中西马特罗残留的检测，前处理无需配备特殊的仪器，具有操作简单、快速，精密度、准确度、灵敏度高，特异性高等特点，适合大量样本的筛查和现场监控。