本发明公开了一种蛋黄油中胆固醇的含量测定方法。本发明的含量测定方法包括（1）供试品溶液的制备；（2）胆固醇成分含量测定：利用高效液相色谱技术测定胆固醇成分含量，对10批供试品溶液进行高效液相色谱测定，得到胆固醇色谱峰的峰面积，根据标准曲线计算供试品中胆固醇的含量，并结合供试品的质量，经计算得到胆固醇的含量为4.33%~7.69%。该方法可以对蛋黄油的质量进行评价，为开发以蛋黄来源的精制胆固醇提供原料的质量分析方法，也为探索开发低胆固醇的蛋黄油提供质量分析方法。该质量检测方法准确、快捷、方便、有效。