本发明涉及一种禽流感H9亚型灭活疫苗，由2株H9亚型禽流感病毒经灭活后和油佐剂混合组成，2株H9亚型禽流感病毒分别为HZ株和FJ株，HZ株的HA基因序列如SEQ ID NO:1所示，FJ株的HA基因序列如SEQ ID NO:2所示。其通过制备H9亚型禽流感病毒HZ株毒液和FJ株毒液，灭活H9亚型禽流感病毒HZ株毒液和FJ株毒液，制备油相溶液，制备水相溶液以及乳化制得。本发明利用2株不同地方分离的H9亚型禽流感毒株制备一种免疫原性强、交叉保护性好的灭活疫苗，能够应用于预防鸡H9亚型禽流感疾病中。该疫苗接种鸡后，抗体效价高，使得鸡对不同地方流行的H9亚型毒株攻毒保护力好，并且安全性高、效力稳定。