本发明涉及一种蛋白质类泛素化修饰位点鉴定方法，该特异性富集标记鉴定方法首先是对纯化后的类泛素化修饰蛋白质进行酶解，通过特异性类泛素化抗体富集类泛素化修饰的酶切肽段，随后利用化学标记对所富集肽段中的非修饰化的赖氨酸氨基残基进行保护，并经去泛素化酶催化反应以裸露出底物肽段序列上被修饰的赖氨酸，经液相色谱串联质谱联用仪分析肽段序列，通过蛋白质质谱数据分析软件匹配得到被化学修饰的肽段序列，其序列中含有游离氨基的赖氨酸位点即为类泛素化修饰位点。与目前常用的基因突变方法获得位点方式比较，本发明的优点是无需繁琐的基因突变技术手段即可快速、高效、准确地得到蛋白质类泛素化修饰位点信息。