本发明公开了一种制备头孢氨苄的方法，该方法是将左旋苯甘氨酸酯类衍生物与7-ADCA按照摩尔比为1.15~1.6:1的比例投料，再按照7-ADCA1~2倍的投料量加入催化剂青霉素酰化酶进行酰化反应；其中所述的青霉素酰化酶其编码的基因序列如SEQ ID NO:3所示。本发明有效克服了酶缩合反应过程中的逆反应，由此大大降低了侧链的使用量、避免了侧链过高消耗所导致的产品杂质多的问题，由此也避免了目的产物难以纯化的问题。与此同时，本发明方法还大大提高了7-ADCA的转化率（采用本发明方法可使7-ADCA平均转化率达到98%以上），由此也进一步提高了产品品质，降低了生产成本。