本发明涉及一种热启动DNA聚合酶的制备方法，包括如下步骤：获得单链DNA结合蛋白、Taq DNA聚合酶单克隆抗体以及Taq DNA聚合酶；将所述单链DNA结合蛋白、所述Taq DNA聚合酶单克隆抗体以及所述TaqDNA聚合酶组分按照比例混合；所述单链DNA结合蛋白、所述Taq DNA聚合酶单克隆抗体以及所述Taq DNA聚合酶的含量分别都为20～40%，本发明还涉及由以上方法制备的热启动DNA聚合酶及其使用方法。本发明制备的热启动DNA聚合酶还可以解决热启动PCR技术中容易出现的DNA损伤、产物污染、封闭不完全导致热启动效果不好的问题。