本发明属于有机化学领域，具体涉及一种可视化含TEMPO聚炔衍生物的制备方法，该制备方法由以下步骤组成，首先将丙炔胺和丁二酸酐在无水二氯甲烷中反应得到N-丙炔基-4-氨基-4-氧代丁酸；将N-丙炔基-4-氨基-4-氧代丁酸和4-羟基-2，2，6，6-四甲基哌啶氧化物进行酯化反应得到含TEMPO的丙炔胺衍生物；将N-丙炔基-4-氨基-4-氧代丁酸和分子量为2000的聚乙二醇进行酯化反应得到含PEG2K的丙炔胺衍生物；然后将含TEMPO的丙炔胺衍生物和含PEG2K的丙炔胺衍生物在40℃下反应12～24h，得到含TEMPO聚炔衍生物；最后将5(6)-羧基荧光素和含TEMPO聚炔衍生物进行酯化反应得到可视化含TEMPO聚炔衍生物。本发明制备的可视化含TEMPO聚炔衍生物具有低细胞毒性，良好的细胞穿透性，可以MRI和荧光显像，应用为MRI对比剂。