本发明公开了一种中国人群耳聋基因筛查试剂盒及其应用。该试剂盒包括：以GJB2基因35位点、109位点、176-199位点、235位点、299-300位点，SLC26A4基因1174位点、1226位点、1229位点、1975位点、2027位点、2162位点、2168位点和IVS7-2位点，线粒体DNA基因1494位点、1555位点、3243位点和7444位点的突变为检测对象而设计的PCR扩增引物和延伸引物，其序列分别如SEQ ID No.1～SEQ ID No.33所示；以及，PCR反应试剂，包括聚合酶及缓冲溶液。利用本发明的试剂盒，通过简单操作，一次可获得多达17个位点的基因型，其成本低廉，且检测通量和检测结果的准确性等较之现有技术均有大幅提升，具有非常好的临床及规模化应用价值。