本发明公开了一种含有CRISPR/Cas9系统的靶向敲除载体及其腺病毒和应用，该靶向敲除载体由pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9质粒用EcoRI和SacII酶切、补平后连接经BstXI酶切、补平的pAdTrack-CMV质粒，然后用BbsI线性化后连入目的基因的特异靶序列，再用PmeⅠ线性化和CIAP碱性磷酸酶去磷酸化后与pAdEasy-1质粒重组而得，获得的靶向敲除载体能够在靶序列区域突变基因序列，且突变率高，达30.6％-45.8％，可以用于基因定点突变，为基因治疗奠定了基础。