本发明公开了一种桉树焦枯病原菌的双重PCR检测试剂盒及其使用方法。本发明的桉树焦枯病原菌的双重PCR检测试剂盒包括(1)10×PCR Buffer；(2)25mmol/L Mg2+；(3)10mmol/L dNTP；(4)引物：10mmol/LCYS1，10mmol/L CYS2，10mmol/L EF-S-1，10mmol/L EF-A-1；其中，引物序列为：CYS1：5＇－CCAGAGGACCCAACAAAC－3＇，CYS2：5＇－CCAGAGCGAGGTGTATTAC－3＇，EF-S-1：5＇－GCAAGAGTCGGATGGAAT－3＇，EF-A-1：5＇－TTGATTGACACTGTGCTAAC－3＇；(5)5U/μL Taq聚合酶；(6)ddH2O。本发明的试剂盒能快速准确的对桉树焦枯病原菌Cylindrocladium scoparium进行分子鉴定和桉树焦枯病的早期诊断。