本发明公开的凝血酶/鞣酸多层膜复合壳聚糖止血海绵的制备方法，步骤包括制备壳聚糖多孔海绵；利用层层自组装法在壳聚糖海绵上组装凝血酶/鞣酸多层膜；将组装好的复合海绵静置过夜脱水，冷冻干燥。本发明通过调节凝血酶/鞣酸双分子层的层数，可以实现凝血酶载药量的调控，即止血效果的可调控。制得的凝血酶/鞣酸多层膜复合壳聚糖止血海绵与自由态凝血酶相比，凝血酶的存储稳定性大大提高，具有止血速度快、效果好的优点，有望应用于战伤和院前急救止血。