本发明公开了一种达氏鲟精子冷冻保存液及制备方法和应用，本发明的达氏鲟精子冷冻保存液包括蔗糖，海藻糖，三羟基氨基甲烷，氯化钾，还原型谷胱甘肽，甲醇。本发明所述的达氏鲟精子冷冻保存液，成分简单，冷冻保存成本低。其中，还原型谷胱甘肽的加入，起到了很好的抗氧化作用，对精子质膜起到很好的保护作用，同时还降低了DNA分子损伤。海藻糖的加入，则具有防止蛋白质变性，有效保护精子的作用。利用本发明的精子冷冻保存液，解冻后精子活力高于70%，受精率达45%。