本发明提供一种牛重大病原菌－多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）的基因诊断试剂盒及检测方法，属于生物科学技术领域。该试剂盒及检测方法是以多杀性巴氏杆菌基因保守区序列设计的一对引物为主体而设计的。本发明采用聚合酶链式反应（PCR）技术，对牛的病原菌－多杀性巴氏杆菌的特异性DNA片断进行定性检测，简便快速，特异性好，灵敏度高；可用于牛巴氏杆菌病的临床检测，也用于牛各时期养殖过程中的细菌跟踪检测，还可以用于牛养殖环境监测，避免病菌传播流行，具有很高的实用价值。