本发明公开了一种预防牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎的二联灭活疫苗及其制备方法和应用。本发明的疫苗其有效成分包括牛病毒性腹泻Ⅰ型病毒灭活抗原以及牛传染性鼻气管炎病毒灭活抗原，可预防不同品种的牛由该两种病毒引起的感染，降低由上述病毒感染造成的经济损失。疫苗可“一针两防”，安全可靠。本发明还提供一种牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎二联灭活疫苗的制备方法，采用传代细胞系培养生产该疫苗，并对该疫苗制备方法中的病毒培养、制备工艺等进行了优化。疫苗安全和效力检验结果显示：使用本发明的二联灭活疫苗免疫牛后没有任何局部和全身不良反应，所有的牛都产生了免疫保护，说明本发明的疫苗安全可靠，可达到“一针两防”的目的。