本发明提供一种用于耐四环素大肠杆菌检测的组合物，包括引物对SEQ ID NO.1/2和引物对SEQ ID NO.3/4。并在此基础上进一步建立mPCR‑DHPLC/电泳检测试剂盒及方法，用以检测食品中携带四环素耐药基因tetA和/或tetB的大肠杆菌四环素耐药株。所建立的方法在一次检测中即可同时高特异性、高灵敏度地完成对样品中的耐四环素大肠杆菌tetA和tetB两种耐药基因的检测，进而确定待检样品是否被携带tetA和tetB耐药基因的四环素耐药性大肠杆菌所污染。此外，所述方法检测耗时短，操作简捷，并具有快速高通量等优点，可以节省大量的劳力和财力，适合快速检测的要求，满足了食品中微生物检测迅速准确的需求。