本发明公开一种基于荧光金纳米团簇的脲酶抑制剂测定方法，其特征是利用脲酶特异性催化尿素生成氨和二氧化碳，新生成的氨能提高体系的pH值，使N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇的荧光发生猝灭，而脲酶抑制剂可以阻止脲酶催化尿素分解这一过程，抑制荧光猝灭，从而用于脲酶抑制剂的检测。测定F650值，计算抑制率，通过软件拟合得到巯基乙胺和对苯醌的IC50分别为2.8 μmol/L和11.9 μmol/L。本发明可应用于脲酶抑制剂的高通量筛选。