一种草乌甲素的高效提取分离方法，包括前处理、浸提、浓缩、酸化、碱化、萃取、柱层析、结晶步骤。该方法用含硫酸3‰的酸性75％乙醇溶液提取三次，碱化在搅拌下缓缓加入浓氨水调pH至8，降低了草乌甲素的损耗；硅胶柱层析，合理有效控制柱层析流速为13～20ml/min，分离效果更佳；用乙酸乙酯萃取，可使溶剂残留物为零，草乌甲素含量最高可达到98～99％，产品纯度高，在草乌药材中草乌甲素的提取率可提高到1.5～2.2‰。本发明方法应用无毒或低毒的有机溶剂和减少有机溶剂种类及使用量，降耗节能，减少了人员危害和环境污染。