本发明涉及一种肠道病毒71型乳胶凝集检测试剂盒及其制备和应用，包括以下物质：（1）致敏原核表达肠道病毒71型VP1特异性抗原的羧化乳胶试剂；（2）致敏三株针对肠道病毒71型VP1的单克隆混合抗体的羧化乳胶试剂；（3）肠道病毒71型阴阳性标准血清，灭活病毒溶液及PBS和（4）含有可供致敏乳胶进行凝集反应的玻片平台及用于混匀乳胶和待反应血清的牙签或塑胶棒。本发明可以检测不同来源样本中的EV71抗原，克服了蛋白致敏普通乳胶时，致敏抗原量少、不稳定、致敏后的蛋白容易脱落等缺点。本发明的检测方法可用于肠道病毒71型的血清流行病学调查、临床辅助诊断以及EV71病毒的复制调控、抗病毒治疗药物筛选等科研领域。