本发明涉及一种原油表面活性剂及其制备方法和应用；在无碱条件下，按照质量百分比由1％～2％的脂肪酸二乙醇酰胺、5％～10％的聚氧乙烯脂肪酰胺和10％～20％的十七烷基二甲基甜菜碱，其余为水组成。其中聚氧乙烯脂肪酰胺和十七烷基二甲基甜菜碱复配质量比为1:2。在无碱条件下，该表面活性剂复配体系在使用浓度为0.0075～0.01％时，45℃下，可与地层脱水原油形成10‑3～10‑4 mN/m的超低界面张力。另外，该体系受地层水矿化度的影响较小，在辽河油田海南三块油砂的吸附量低于0.5mg/g。该复配体系适用于油藏注水开发中后期采取的一元驱或二元驱技术，为油田三次采油提供一定的技术支撑。