本发明公开了一种适用于玉米赤霉烯酮及其代谢物在线富集及分离的方法，是利用毛细管电色谱技术，以十八烷基键合硅胶毛细管填充柱，或由乙烯基苄氯为功能单体、笼型八乙烯基倍半硅氧烷为交联剂组成的聚合物整体柱作为有机-硅胶杂化毛细管整体柱，在杂化毛细管整体柱上同时施加负电荷高压电场和液相泵辅助压力，应用高压电场驱动和毛细管微流液相分配分离的双重作用，实现玉米赤霉烯酮及其代谢物的在柱富集和多组分连续分离，从而实现玉米赤霉烯酮及其代谢物的定量分析。本发明综合应用了毛细管柱在线富集、高压电场驱动和毛细管微流液相分离等多重作用，无需进行待测组分离线处理，流程连续、灵敏度高，可用于玉米赤霉烯酮及其代谢物的痕量分析。