本发明提供了一种利用硅胶层析纯化超级泰乐菌素的新方法，该方法是以柱层层析硅胶为分离介质，以下述物质组成的混合液为洗脱液，对3‑O‑乙酰‑4”‑O‑异戊酰泰乐菌素粗品进行纯化：1)石油醚；2)乙酸乙酯和/或乙酸丁酯；和3)二乙胺、三乙胺和N,N‑二异丙基乙基胺中的一种或多种，对3‑O‑乙酰‑4”‑O‑异戊酰泰乐菌素粗品进行纯化，并通过旋转蒸发以获得高纯度3‑O‑乙酰‑4”‑O‑异戊酰泰乐菌素。本发明所述方法可以有效去除杂质，克服了现有超级泰乐菌素提纯工艺制得的产品纯度过低的问题。应用本发明提供的方法制备超级泰乐菌素，其产品纯度可以达到97％以上。